PCR
Ideata nel 1983 dal biochimico statunitense Kary Banks Mullis, la PCR, o Reazione a Catena della Polimerasi, è una tecnica della biologia molecolare che permette di amplificare specifiche sequenze di DNA, ottenendo così una quantità sufficiente di materiale genetico per poter eseguire studi più approfonditi in ambiti che spaziano dalla ricerca biomedica alla biologia forense alle analisi alimentari e microbiologiche.
Il processo enzimatico di amplificazione degli acidi nucleici è reso possibile da variazioni cicliche di temperatura che permettono, ad ogni ciclo, il susseguirsi di tre step fondamentali:
- Denaturazione: un primo incremento di temperatura porta alla separazione dei due filamenti che costituiscono la molecola di DNA e che verranno utilizzati come “filamenti stampo” per l’amplificazione.
- Annealing: l’abbassamento della temperatura consente il legame dei primer, specifici per la sequenza che si vuole amplificare, ai singoli filamenti di DNA stampo.
- Allungamento: ad una temperatura che dipende dalla DNA polimerasi utilizzata, durante la fase di allungamento, la DNA polimerasi utilizza i primer come innesco per sintetizzare, con i nucleotidi presenti nella mix di reazione, un filamento di DNA complementare a quello utilizzato come stampo.
Alla fine di ognuno di questi cicli, la quantità di DNA raddoppia, andando dunque a crescere esponenzialmente durante l’intero processo di amplificazione.
REAL-TIME PCR
La REAL-TIME PCR rappresenta un’evoluzione della tecnica della PCR, perché permette non solo di amplificare un campione di DNA, ma anche di seguire in “Real-Time” ciclo per ciclo, l’amplificazione del campione stesso.
Questo è reso possibile dall’utilizzo di :
- intercalanti fluorescenti: molecole che si inseriscono nella doppia elica di DNA in modo aspecifico.
- sonde fluorescenti: corte sequenze nucleotidiche specifiche per la sequenza del filamento di DNA che si vuole amplificare.
Utilizzando una di queste due tecnologie, durante l’amplificazione viene generato un segnale fluorescente che aumenta con l’accumularsi del prodotto amplificato. Questo segnale viene rilevato dallo strumento ed utilizzato per elaborare delle curve di amplificazione che consentono di seguire l’andamento della reazione ciclo per ciclo.
RT-PCR
Un’altra tecnica della biologia molecolare che si è evoluta dalla PCR, è la RT-PCR, che unisce la Real-Time PCR alla retrotrascrizione, meccanismo che consiste nel sintetizzare una molecola di DNA a partire da uno stampo a RNA. Questa tecnica permette, dunque, di retrotrascrivere RNA estratto dal campione in analisi in cDNA e successivamente di amplificarlo secondo i meccanismi descritti nei paragrafi precedenti.
RT-PCR per la DIAGNOSI MOLECOLARE
Nell’ultimo anno, questa tecnica ha riscosso un enorme successo per la diagnosi molecolare del Covid-19, malattia infettiva causata proprio da un virus a RNA.
Per favorire la battaglia contro il Covid-19, la SIMITECNO ha messo a punto un kit di strumenti e reagenti per una diagnosi molecolare al “Point-of-Care”, utilizzabile non solo presso centri diagnostici e pronto soccorso, ma anche in case di cura, aziende, uffici, studi di produzione ecc… grazie all’organizzazione di laboratori mobili.
Ad oggi il kit per la diagnosi molecolare al “Point-of-Care” comprende:
- tamponi con liquido inattivante
- estrattore automatico di acidi nucleici *
- sistema Real-Time PCR compatta e leggera SHINEWAY SWM-02
*è in corso una ricerca volta all’identificazione di nuovi reagenti che consentano di eliminare la fase di estrazione pur garantendo l’efficienza dell’amplificazione
QUALI SONO GLI STEP DELLA DIAGNOSI MOLECOLARE?
1.RACCOLTA DEL CAMPIONE
I kit comprendono un tampone utilizzabile per la raccolta del campione sia nell’orofaringe che nel rinofaringe e una provetta con liquido di trasporto inattivante che abbatte il rischio biologico inibendo l’infettività del virus.
2.ESTRAZIONE ACIDI NUCLEICI
L’estrazione automatica degli acidi nucleici riduce significativamente l’errore umano e accorcia i tempi di processamento del campione, arrivando ad estrarre l’RNA in appena 11 minuti.
Nonostante la comprovata efficienza di questi strumenti e la loro effettiva trasportabilità, non si può negare che, in specifiche circostanze, l’eliminazione dello strumento favorirebbe notevolmente gli spostamenti degli operatori responsabili della diagnosi al “Point-of-Care”.
Per questo motivo, la SIMITECNO è attivamente impegnata nella ricerca e nella sperimentazione di nuovi reagenti che permettano di bypassare il processo di estrazione. Lo scopo di questo progetto è quello di perfezionare il kit per la diagnosi molecolare proposto in modo che possa essere fruibile a quante più realtà possibili.
3.RT-PCR
La RT Real-Time PCR consente di retrotrascrivere l’RNA precedentemente estratto in cDNA e, successivamente, di amplificare quest’ultimo allo scopo di rilevarne la presenza qualora il campione dovesse essere positivo.
Il kit di reagenti proposto prevede l’utilizzo di sonde TaqMan per il rilevamento di due geni virali (ORF1ab e N) e di un gene umano (beta-globina) che agisce da controllo endogeno.
Come agisce la sonda TaqMan?
La sonda è costituita da un oligonucleotide (una piccola molecola di acido nucleico a singolo filamento) alle cui estremità sono legati da una parte un fluoroforo, e dall’altra un “quencher”. In questa conformazione, il “quencher” smorza la fluorescenza del fluoroforo e quindi non viene emesso alcun segnale. Durante l’amplificazione, l’azione della Taq DNA polimerasi fa sì che il fluoroforo venga separato dalla sonda e allontanato dalla stessa. Allontanandosi dal “quencher”, il fluoroforo emette il segnale fluorescente che viene rilevato dallo strumento per l’elaborazione dei risultati del test.
Risultati di un test molecolare eseguito con sistema Shineway SWM-02
Figura 1. Curve di amplificazione di un campione positivo per il SARS-CoV2:
- curva verde per ORF1ab
- curva gialla per N
- curva rossa per beta-globina umana (controllo endogeno)
Figura 2. Valori Ct per i 3 geni rilevati
Figura 3. Immagine dei canali di reazione al primo e al 45 ciclo di amplificazione: nel primo canale, corrispondente ad un campione positivo, è evidente l’aumento del segnale di fluorescenza dovuto all’amplificazione della regione ORF1ab.
+ INFO: giorgia.difeo@simitecno.it