Coronavirus e la corsa per distribuire diagnostica affidabile

Da SARS-CoV. a SARS-CoV-2

I team internazionali hanno lavorato rapidamente per rendere disponibili i test per il virus in tempi record. La comunità medica si sta radunando per sviluppare una serie di test diagnostici molecolari rapidi e affidabili per il nuovo coronavirus umano che è apparso in Cina – ora soprannominato sindrome respiratoria acuta improvvisa coronavirus-2 (SARS-CoV-2).

Ciò fa seguito a uno sforzo da parte di diversi gruppi di ricerca per identificare e sequenziare il virus, condividendo diversi genomi virali in database aperti nelle ultime settimane. Mentre le infezioni continuano a  crescere migliaia di persone sono state segnalate per essere state infettate in Cina a partire dalla mezzanotte del 18 febbraio 2020 – e le autorità cercano di diagnosticare e documentare accuratamente le infezioni, aumenta la necessità di diagnosi rapide e affidabili. Sebbene molte cliniche non abbiano ancora accesso a un test SARS-CoV-2 robusto, accurato e sensibile, nel giro di poche settimane sono stati compiuti notevoli progressi. Al contrario, ci sono voluti quasi sei mesi per identificare e stabilire saggi per il coronavirus responsabile dell’epidemia di SARS 2002-2003 .

Dopo che gruppi di casi di polmonite di nessuna causa nota sono stati epidemiologicamente collegati a un mercato ittico e di alimenti per animali “umidi” a Wuhan, in Cina, tre gruppi hanno lavorato instancabilmente per identificare il colpevole. In primo luogo, i ricercatori di Shanghai, Wuhan, Pechino e Sydney hanno utilizzato il sequenziamento metagenomico dell’RNA per identificare il coronavirus precedentemente sconosciuto in un campione di un singolo paziente che aveva lavorato sul mercato. Il team ha depositato una bozza di sequenza del genoma nel repository di sequenze GenBank disponibile al pubblico il 10 gennaio; la versione attuale è stata depositata il 17 gennaio.

Più o meno nello stesso periodo, un team di risposta rapida inviato dal Centro cinese per il controllo e la prevenzione delle malattie ha riferito di aver isolato e coltivato un nuovo coronavirus dal liquido di lavaggio broncoalveolare di tre pazienti e lo ha identificato come la probabile fonte dell’epidemia. Le osservazioni al microscopio elettronico hanno scoperto una tipica morfologia del coronavirus; Il lavoro di microscopia ottica ha dimostrato di avere effetti citopatici sulle cellule epiteliali delle vie aeree umane. Il sequenziamento del genoma ha rivelato che il virus condivideva oltre l’85% dell’identità della sequenza con un noto coronavirus simile alla SARS trovato nei pipistrelli. Il 12 gennaio, questo gruppo ha depositato altre tre sequenze di genomi nel database ad accesso aperto Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID).

Un terzo gruppo di scienziati, con sede a Wuhan e Pechino, ha identificato e caratterizzato lo stesso virus in altri cinque pazienti con polmonite grave e ha depositato altri cinque genomi con GISAID. Hanno anche dimostrato che il virus utilizza l’enzima II di conversione dell’angiotensina (ACE2) per ottenere l’accesso alle cellule ospiti, così come SARS-CoV, il ceppo che ha causato l’epidemia del 2002-2003, che ha infettato 8.096 persone e causato 774 morti .

Diversi gruppi internazionali hanno lavorato su questi dati di sequenza per progettare primer per test di reazione a catena della polimerasi (PCR) per supportare i laboratori di sanità pubblica globali in assenza di un test commerciale per SARS-CoV-2 (precedentemente 2019-nCoV). Il laboratorio di Christian Drosten, dell’Institute of Virology, Charité University Hospital di Berlino, insieme a collaboratori accademici in Europa e Hong Kong, ha pubblicato i dettagli di un test diagnostico PCR (RT-PCR) in tempo reale e flusso di lavoro il 23 gennaio, che rileva SARS-CoV-2 e lo distingue da SARS-CoV. Il gruppo ha verificato il test in assenza di isolati SARS-CoV-2 o campioni di pazienti, ma ha confermato la sua specificità rispetto a 297 campioni clinici di pazienti con varie altre infezioni respiratorie. Ciò ha costituito la base delle spedizioni di 250.000 kit, che l’Organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha inviato a 159 laboratori in tutto il mondo nelle ultime settimane.

Nel frattempo, un gruppo dell’Università di Hong Kong ha sviluppato due test PCR quantitativi in una fase di trascrizione inversa RT indirizzati sia al frame di lettura aperto 1b ( ORF1b ) sia alle regioni N del genoma virale in base alla prima sequenza depositata presso GenBank; questi due test sono stati validati usando due campioni clinici ottenuti da pazienti infetti da SARS-CoV-2. I test sono esplicitamente progettati per identificare più virus nel sottogenere sarbecovirus a cui appartiene SARS-CoV-2, data la mancanza di dati sulla diversità genetica di SARS-CoV-2 nell’uomo e negli animali. Poiché non è noto che nessun altro sarbecovirus circoli nell’uomo, un test positivo può essere considerato una conferma che un soggetto è infetto da SARS-CoV-2 o da un virus animale correlato. IlSi consiglia il test del gene N come test di screening e il test ORF1b come test di conferma. L’algoritmo diagnostico è simile a quello seguito per il coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS), che è stato identificato per la prima volta in Arabia Saudita nel 2012. “Fondamentalmente abbiamo appena provato ad adottare la stessa strategia”, afferma Leo Poon, professore nella scuola di sanità pubblica all’università di Hong Kong. Il suo gruppo ha condiviso i dettagli del test – e in alcuni casi i reagenti – con l’OMS e con oltre 30 laboratori in Asia, Africa, Medio Oriente e Sud America.

Il test PCR è altamente sensibile, se utilizzato correttamente. “Nelle nostre mani, abbiamo una sensibilità di dieci copie per reazione”, afferma Poon. Tuttavia, i falsi negativi – l’incapacità di rilevare il virus nei pazienti infetti – possono essere un problema significativo nelle impostazioni ad alto rendimento che operano sotto pressione grave. Il corretto funzionamento del test è cruciale. Inoltre, ci sono ancora incertezze riguardo alla cinetica dello spargimento virale SARS-CoV-2, quindi i tempi del test possono influenzare il risultato. Non è ancora chiaro quali tipi di campione clinico siano ottimali. Uno studio recente di Wuhan , che ha valutato le prestazioni di un kit RT-PCR basato sulla fluorescenza distribuito dal Centro cinese per il controllo e la prevenzione delle malattie, suggerisce che i tamponi rinofaringei offrono maggiore consistenza rispetto ai campioni di espettorato.

Negli Stati Uniti, il CDC (Centers for Disease Control and Prevention) ha implementato i propri test PCR in tutti i 50 stati degli Stati Uniti e in 30 località internazionali dopo aver ottenuto l’autorizzazione all’uso di emergenza dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti su 4 febbraio. Ma i laboratori di test statali hanno scoperto un problema di qualità con un elemento del saggio in tre parti. “Se aumenti rapidamente ciò che può accadere”, afferma Marion Koopmans, responsabile della viroscienza presso l’Erasmus Medical Center di Rotterdam, nei Paesi Bassi, che è stato coinvolto nello sviluppo del test di Berlino.

Questi primi test di laboratorio fanno guadagnare tempo. Forniscono alle autorità sanitarie pubbliche alcuni strumenti diagnostici prima che i prodotti e i kit commerciali siano disponibili su vasta scala (Tabella 1). In Cina, la società di sequenziamento del genoma BGI Group, di Shenzhen, è già operativa e produce tali test commerciali. Alla fine di gennaio aveva già distribuito oltre 50.000 kit di test in tutta la Cina. Il 5 febbraio ha aperto un laboratorio di test di emergenza a Wuhan in grado di processare 10.000 campioni al giorno. Altre aziende stanno sviluppando i loro test più lentamente, ma l’implementazione iniziale è imminente. Non tutti si affidano a progetti e protocolli di primer specificati da laboratori accademici o autorità sanitarie pubbliche. “Siamo giunti alla conclusione che questi test non sono ottimali per noi, nelle nostre mani”, afferma Stephan Ölschläger, responsabile marketing di Altona Diagnostics, con sede ad Amburgo, in Germania.E gene del lignaggio B betacoronavirus e una regione del gene S specifica per SARS-CoV-2.

Anziché sviluppare test PCR personalizzati, IDbyDNA è una delle poche aziende che impiegano l’analisi dell’acido nucleico metagenomico come strumento diagnostico e di sorveglianza di routine. L’attuale test Explify Respiratory, che è un test sviluppato in laboratorio (o “brew casalingo”), può identificare oltre 900 agenti patogeni respiratori, tra cui virus, batteri, funghi e parassiti, confrontando i dati metagenomici imparziali ottenuti da campioni di pazienti con un ampio repository di dati di sequenza. Può già rilevare il ceppo SARS-CoV-2. “Ora abbiamo aggiornato i nostri dati con il nuovo coronavirus e stiamo procedendo a una nuova convalida”, afferma Robert Schlaberg, cofondatore e responsabile medico. “Le modifiche sono tutte sul lato dell’analisi dei dati.” Questo è, dice, un processo più semplice rispetto all’aggiornamento di un test fisico. L’analisi dei dati effettivi richiede meno di un’ora; il tempo di consegna dalla ricezione del campione al risultato del test è di 36 ore. Sebbene sia più costoso dei test PCR, i costi in calo del sequenziamento potrebbero aiutare a democratizzare questo approccio. La società sta vendendo la tecnologia e i suoi servizi di collaudo. “I test diagnostici tradizionali e la sorveglianza sono due sforzi separati”, afferma. “È molto più veloce avere un monitoraggio in tempo reale di ciò che è in circolazione.”

Andrew Rambaut, dell’Università di Edimburgo, in Scozia, lo sta già facendo, monitorando l’epidemia analizzando le relazioni filogenetiche tra i diversi genomi SARS-CoV-2. I virus dell’RNA hanno un processo di replica soggetto a errori e le variazioni genetiche introdotte costituiscono un orologio molecolare in grado di fornire informazioni sull’emergenza iniziale e sull’evoluzione continua del virus. “L’orologio molecolare fornisce un modo per cambiare i cambiamenti genetici nel tempo”, afferma. Un’analisi iniziale , basata su 90 genomi disponibili pubblicamente, suggerisce che la SARS-CoV-2 è emersa non molto tempo prima che si verificassero i primi casi di polmonite a Wuhan. “Non anticipa molto i tempi del rilevamento della malattia”, afferma Koopmans.

Gli epidemiologi hanno anche adattato gli strumenti di sorveglianza digitale per tracciare il nuovo focolaio di coronavirus monitorando automaticamente informazioni elettroniche strutturate e non strutturate da fonti ufficiali e non ufficiali. Il Center for Systems Science and Engineering della Johns Hopkins University ha sviluppato una dashboard basata sul Web per visualizzare e tenere traccia dei casi segnalati di SARS-CoV-2 in tempo reale. I dati sottostanti sono liberamente disponibili per gli scienziati attraverso un repository GitHub. La fonte principale della dashboard è DXY , una risorsa online gestita da membri della comunità medica cinese, che aggregano rapporti ufficiali e dei media sullo sviluppo dell’epidemia. HealthMap.org, sviluppato più di un decennio fa per tenere traccia delle epidemie di malattie infettive, ha anche rilasciato un’interfaccia specifica per SARS-CoV-2. Il crowdsourcing e il recupero automatico delle informazioni sono stati sfruttati per sviluppare un elenco di linee elettroniche condivise per il monitoraggio dell’epidemia di SARS-CoV-2, caso per caso. Al 19 febbraio, l’elenco conteneva informazioni demografiche, geografiche e cliniche su oltre 7.800 singoli casi, che consente ai ricercatori di condurre analisi per comprendere i modelli di diffusione. “Molti gruppi utilizzano i dati, quindi è una cosa incoraggiante”, afferma Moritz Krämer, ricercatore presso il Dipartimento di Zoologia dell’Università di Oxford, che ha creato la risorsa. L’attuale crisi è, dice, caratterizzata da un ethos di condivisione dei dati molto più forte rispetto alle epidemie precedenti. “Penso che abbiamo imparato.”

Una miriade di incertezze circonda ancora la traiettoria dell’epidemia. Sul lato positivo, gli sforzi di contenimento al di fuori della Cina sembrano, almeno finora, avere successo. Il numero di casi confermati in altri paesi rimane basso e ci sono poche prove a questo punto della trasmissione diffusa della comunità. In Cina, tuttavia, e in particolare nella provincia di Hubei – l’epicentro dell’epidemia, che rimane in blocco – il quadro non è ancora chiaro. La maggior parte dei casi non è ancora stata risolta. Inoltre, la dimensione dell ‘”iceberg” non è definita: è ancora troppo presto per sapere se restano ulteriori bacini di infezione non rilevati. Non c’è fine immediata in vista dello straordinario calvario che milioni di persone stanno vivendo nelle città di Hubei.

TABELLA 1 | TEST DIAGNOSTICI SELEZIONATI PER SARS-COV-2

AGGIORNAMENTI E CORREZIONI

• Aggiornamenti : nella versione originale di questo articolo, il test sviluppato da Altona Diagnostics era descritto come mirante al gene F quando avrebbe dovuto dire il gene S. L’errore è stato corretto. Il contenuto della tabella è stato aggiornato il 26 febbraio 2010 con le informazioni di TIB Molbiol.